一、PCR技術服務概述及原理

　　PCR(Polymerase Chain Reaction)即(ji)聚合酶(mei)鏈式反(fan)應，是(shi)在(zai)DNA聚合酶(mei)的(de)(de)催(cui)化下，以(yi)特(te)(te)定的(de)(de)DNA為模板(ban)(ban)，以(yi)特(te)(te)定的(de)(de)核酸片段即(ji)PCR引物為擴增(zeng)起點和終點，通過(guo)變性、退火、延(yan)伸等步驟，在(zai)體外(wai)體系(xi)中(zhong)復制出大(da)量(liang)與母鏈模板(ban)(ban)中(zhong)所需的(de)(de)DNA片段互補的(de)(de)子鏈DNA的(de)(de)過(guo)程(cheng)。

　　PCR的(de)(de)大特(te)點是(shi)其擴(kuo)增(zeng)產物(wu)(wu)的(de)(de)特(te)異性(xing)、擴(kuo)增(zeng)效率(lv)的(de)(de)靈敏(min)性(xing)、擴(kuo)增(zeng)程序(xu)的(de)(de)簡(jian)便性(xing)。引物(wu)(wu)序(xu)列(lie)及其與模板結(jie)合(he)的(de)(de)特(te)異性(xing)是(shi)決(jue)定PCR反(fan)應(ying)結(jie)果的(de)(de)關(guan)鍵。PCR技(ji)(ji)術(shu)(shu)是(shi)一種(zhong)DNA體外合(he)成放大技(ji)(ji)術(shu)(shu)，具有擴(kuo)增(zeng)效率(lv)高(gao)，擴(kuo)增(zeng)特(te)異性(xing)高(gao)，擴(kuo)增(zeng)體系和技(ji)(ji)術(shu)(shu)簡(jian)便成熟的(de)(de)特(te)點，是(shi)當今生物(wu)(wu)學(xue)相關(guan)實驗室廣泛使用的(de)(de)一項技(ji)(ji)術(shu)(shu)。

　　二、PCR技術服務的循環步驟

　　PCR反應(ying)(ying)過程實際上是一個溫度循環變化的過程，一般包括(kuo)變性---退火---延伸三個基本反應(ying)(ying)步驟(zou)，其基本步驟(zou)如(ru)下(xia)：

　　(1)模(mo)板(ban)DNA的(de)(de)變性(xing)：模(mo)板(ban)DNA經(jing)加(jia)熱至92～96℃以(yi)(yi)上(shang)保(bao)溫1～3分(fen)鐘，使模(mo)板(ban)DNA雙(shuang)鏈(lian)或經(jing)PCR擴(kuo)增形成(cheng)的(de)(de)雙(shuang)鏈(lian)DNA解離，使之成(cheng)為單鏈(lian)，以(yi)(yi)便它與引(yin)物(wu)結合，為下輪反(fan)應(ying)作準備;雖然變性(xing)時(shi)間決定于多(duo)種因素模(mo)板(ban)DNA的(de)(de)復雜性(xing)、反(fan)應(ying)管的(de)(de)幾(ji)何(he)學、PCR儀的(de)(de)種類甚至反(fan)應(ying)體積，但(dan)是實際(ji)經(jing)驗(yan)中(zhong)，94℃保(bao)溫3分(fen)鐘即可以(yi)(yi)滿足絕大部分(fen)反(fan)應(ying)的(de)(de)需求。另(ling)外，對于GC含(han)量較(jiao)高的(de)(de)DNA模(mo)板(ban)，加(jia)入甘油、延長時(shi)間、應(ying)用核酸類似物(wu)可以(yi)(yi)提高PCR產(chan)物(wu)的(de)(de)產(chan)量。

　　(2)模板DNA與引物(wu)的(de)(de)退火(復性(xing))：模板DNA經(jing)加熱變性(xing)成(cheng)單鏈后，37～65℃保溫(wen)0.5～1分鐘，寡核(he)苷酸(suan)(suan)引物(wu)與模板DNA單鏈的(de)(de)互補序(xu)列配對(dui)結(jie)合(he);這一(yi)步(bu)的(de)(de)溫(wen)度取決于引物(wu)與靶序(xu)列的(de)(de)同源性(xing)程(cheng)度和寡核(he)苷酸(suan)(suan)引物(wu)的(de)(de)堿基組(zu)成(cheng)。引物(wu)的(de)(de)摩(mo)爾數由(you)于大于靶序(xu)列，因此它們與互補序(xu)列的(de)(de)配對(dui)速度在反應中比模板雙鏈之間的(de)(de)重新(xin)配對(dui)要(yao)快幾個(ge)數量級(ji)。

　　(3)引物(wu)(wu)的延伸(shen)：DNA模板(ban)---引物(wu)(wu)結合(he)物(wu)(wu)體系(xi)在(zai)68～72℃延伸(shen)保(bao)(bao)溫相應時間(jian)(此步驟具體溫度視熱(re)穩定(ding)DNA聚(ju)合(he)酶的種類而定(ding)，而保(bao)(bao)溫時間(jian)則在(zai)考慮DNA聚(ju)合(he)酶效(xiao)率的基礎上(shang)，依據(ju)反應產物(wu)(wu)的長度決定(ding)，如目(mu)前常(chang)用(yong)的DNA聚(ju)合(he)酶Taq酶在(zai)72℃下每分鐘約可以(yi)擴(kuo)(kuo)增(zeng)長度為1Kb左右的DNA片(pian)段，因此要(yao)擴(kuo)(kuo)增(zeng)兩2Kb的DNA片(pian)段時本步驟的保(bao)(bao)溫溫度應設(she)置為72℃、時間(jian)為2分鐘)，在(zai)DNA聚(ju)合(he)酶的作用(yong)下，以(yi)dNTP為反應原(yuan)料，靶序(xu)列為模板(ban)，按堿基配對與半保(bao)(bao)留復制原(yuan)理，合(he)成一條(tiao)新的與模板(ban)DNA 鏈(lian)互補的半保(bao)(bao)留復制鏈(lian)。

　　重復循(xun)環變(bian)性---退火---延(yan)伸三過程(cheng)，就可獲得更多的“半保留(liu)復制鏈”，而(er)且這種新鏈又可成為下次循(xun)環的模(mo)板(ban)使(shi)得每個(ge)循(xun)環中新擴增的目的片段數(shu)量(liang)以指數(shu)式增長。經過一定(ding)數(shu)量(liang)的循(xun)環之(zhi)后，待擴目的DNA片段的數(shu)量(liang)將被擴增放大幾百萬倍。到達平臺(tai)期所需(xu)循(xun)環次數(shu)取(qu)決于樣品中模(mo)板(ban)的拷(kao)貝。