小鼠白細胞介素10試劑盒的操作方法

白介素10是(shi)一種多(duo)細胞(bao)源、多(duo)功能(neng)的(de)細胞(bao)因(yin)子 ，調節細胞(bao)的(de)生長與分化，參與炎性反(fan)應和免(mian)(mian)疫反(fan)應，是(shi)目前炎癥(zheng)與免(mian)(mian)疫抑制因(yin)子。在腫瘤、感染、造(zao)血(xue)(xue)系統及心血(xue)(xue)管(guan)系統中發揮重要(yao)作用 ，與血(xue)(xue)液、消(xiao)化、尤其是(shi)心血(xue)(xue)管(guan)系統疾病密切相關。

在1989年，Mosmannand及他(ta)們的(de)同事(shi)描(miao)述了一種新的(de)免疫介質，由Th2細(xi)胞克(ke)隆分泌，能(neng)夠(gou)抑制(zhi)Th1細(xi)胞克(ke)隆IL-2和IFNr的(de)合成。早期(qi)被命(ming)(ming)名為(wei)(wei)細(xi)胞因子(zi)合成抑制(zhi)因子(zi)(CSIF)，這種因子(zi)后來被命(ming)(ming)名為(wei)(wei)IL-10，在這被發現的(de)21年期(qi)間，很多研(yan)究深(shen)入剖析了這個細(xi)胞因子(zi)的(de)生(sheng)物(wu)學特性。

細胞的來源：

目前已知并非只有特定的T細胞亞群才能合成IL-10，幾乎所有淋巴細胞均能合成IL-10。體內最重要的來源主要是單核巨噬細胞和T輔助細胞，此外，樹突狀細胞，B細胞，細胞毒性T細胞，γδT細胞，NK細胞，肥大細胞以及中性粒細胞和嗜酸性細胞也能合成IL-10，這些細胞分泌IL-10主要決定于特定的刺激，受損組織類型和某種免疫反應時間點。
單核巨(ju)(ju)噬細(xi)胞(bao)(bao)在(zai)各(ge)種內源性(xing)和(he)(he)(he)外源性(xing)介質的作用下激(ji)(ji)(ji)(ji)活(huo)(huo)后分(fen)泌IL-10，如LPS(通(tong)過(guo)(guo)激(ji)(ji)(ji)(ji)活(huo)(huo)TLR4,TRAF3,NF-κBp65/p50,和(he)(he)(he)ERK激(ji)(ji)(ji)(ji)酶)、兒茶酚(fen)胺(通(tong)過(guo)(guo)激(ji)(ji)(ji)(ji)活(huo)(huo)蛋白激(ji)(ji)(ji)(ji)酶A和(he)(he)(he)CREB-1/ATF-1)引起IL-10基因轉(zhuan)錄(lu)(lu)。單核巨(ju)(ju)噬細(xi)胞(bao)(bao)在(zai)清(qing)除(chu)凋(diao)亡(wang)細(xi)胞(bao)(bao)過(guo)(guo)程(cheng)中也(ye)會(hui)分(fen)泌IL-10，這一過(guo)(guo)程(cheng)依賴于CD36和(he)(he)(he)p38絲(si)裂(lie)原激(ji)(ji)(ji)(ji)活(huo)(huo)蛋白(MAP)激(ji)(ji)(ji)(ji)酶，除(chu)了轉(zhuan)錄(lu)(lu)水平，等最近認為IL-10也(ye)被microRNA在(zai)轉(zhuan)錄(lu)(lu)后期所調節。

操作步驟：

1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀
釋。
1000pg/ml 5 號標準品150μl 的原倍標準品加入150μl 標準品稀釋液
500pg/ml 4 號標準品150μl 的5 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
250pg/ml 3 號標準品150μl 的4 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
125pg/ml 2 號標準品150μl 的3 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
62.5pg/ml 1 號標準品150μl 的2 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待
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測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl， 然
后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不
觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
4. 配液：將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此
重復5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11. 測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終止液
后(hou)15 分鐘(zhong)以內進行。