明膠酶譜分析試劑盒

MMP-2&MMP-9明膠(jiao)酶(mei)譜法檢測試(shi)劑盒說(shuo)明書

1. 簡介：

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以(yi)無活(huo)性的(de)酶(mei)原(yuan)形式(shi)分泌，活(huo)化后能夠降解細胞(bao)外基質的(de)膠(jiao)原(yuan)蛋白(bai)，又(you)稱膠(jiao)原(yuan)酶(mei)。通過(guo)影響(xiang)細胞(bao)外基質，膠(jiao)原(yuan)酶(mei)參(can)與(yu)胚胎發(fa)(fa)育、形態(tai)發(fa)(fa)生(sheng)、組織重塑(su)等(deng)(deng)過(guo)程(cheng)，并(bing)參(can)與(yu)炎癥、腫瘤、心血管、神經等(deng)(deng)許多疾病過(guo)程(cheng)。血漿與(yu)組織中的(de)MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過(guo)程，其在診斷(duan)和治(zhi)療中的意義日益受到重視。

2. 檢測原理(li)：

本試劑盒采(cai)用(yong)酶譜法(Zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活(huo)性。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電(dian)泳和反相凝膠染(ran)色的蛋白酶檢(jian)測方法，其靈敏度可達1 nM，高于(yu)ELISA方法，其基本原(yuan)理(li)1和程序(xu)是：制備加有(you)膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶(mei)的樣品在(zai)此凝膠中進行電泳，電泳結(jie)束后取出(chu)凝膠與酶(mei)反應Buffer 孵育，凝(ning)膠染色與脫色。凝(ning)膠中(zhong)(zhong)由于含底(di)物蛋白而(er)(er)被(bei)深(shen)染，形(xing)成深(shen)色背景，但在有(you)蛋白酶條帶的(de)位置，蛋白酶將降解凝(ning)膠中(zhong)(zhong)的(de)底(di)物蛋白，因(yin)而(er)(er)不被(bei)染色而(er)(er)形(xing)成透亮區域，從而(er)(er)能同時(shi)指示MMP-2、MMP-9 的大小(xiao)位置(zhi)(酶譜)及活性(xing)。本試劑盒提(ti)供MMP-2、MMP-9 特(te)異蛋白底(di)物及酶學反應緩沖(chong)液(ye)，可檢測(ce)少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜(pu)及(ji)活性(xing)，檢測靈敏度~1nM。試劑盒(he)可進(jin)行(xing)50次標(biao)準小膠(jiao)(jiao)檢測，如果小膠(jiao)(jiao)加樣孔(kong)為10~15個(ge)，則總計可檢測(ce)500~750個樣品。

3. 檢(jian)測(ce)目(mu)的:

本試劑盒用于(yu)檢測MMP-2、MMP-9 酶譜及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM）。

4.  試劑盒組成與儲存：

A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, ?20 oC；

B. 10 × Substrate G, 50 ml, ?20 oC；

C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 oC, 使用(yong)時用(yong)蒸(zheng)餾水稀釋；

D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 oC, 使(shi)用時用蒸(zheng)餾水(shui)稀釋；

E. SDS-PAGE 凝膠蛋(dan)白質考(kao)馬斯亮藍染色液, 4 oC。

5.檢測步驟：

5.1 制備含MMP底(di)物蛋白的SDS-PAGE凝(ning)膠：分離膠濃(nong)度為8%。按照標準(zhun)程序制(zhi)備SDS PAGE凝膠(jiao)。將10 × substrate G 融(rong)化，并90 oC 加熱5分(fen)鐘。分(fen)別在濃縮膠和分(fen)離(li)膠中(zhong)額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍(bei)，混勻后加入過(guo)硫酸(suan)銨和TEMED，等待凝膠聚合。

5.2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后(hou)可(ke)自(zi)行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混(hun)合(he)后直接(jie)上(shang)樣(yang)。切勿加熱(re)變性(xing)，并且僅使用不加還原(yuan)劑的上(shang)樣(yang)緩沖液。可通過預(yu)試(shi)驗確定加樣(yang)量(liang)，使用普通蛋(dan)白預(yu)染Marker 即可。

陽性(xing)對照(可選步(bu)驟)：可取人、小鼠、大(da)鼠或(huo)兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。

注：因為全血(xue)成(cheng)分復雜,MMP活性較(jiao)低，的(de)方法是(shi)將全血(xue)中(zhong)白細胞進行分離做陽性對(dui)照

5.3 低電流(liu)恒流(liu)電泳，每(mei)一塊小膠電流(liu)為20 mA/gel。溴酚藍跑出(chu)凝膠前沿(yan)時(shi)結束電泳。

5.4 洗滌(di)凝(ning)膠(jiao)：取出(chu)凝(ning)膠(jiao)，去除(chu)濃(nong)縮膠(jiao)，放(fang)入容器內。可先用適量蒸餾水(shui)沖洗凝(ning)膠(jiao)，然后(hou)加入10 ml 1× Buffer A(用蒸(zheng)餾水稀(xi)釋)，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。

5.5 孵(fu)育(yu)：倒掉Buffer A。加入(ru)10 ml 1× Buffer B(蒸(zheng)餾(liu)水稀釋)，室溫或37oC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常37oC 孵育(yu)1 小時即可顯示(shi)。如MMP 活(huo)性低，應延長孵育時(shi)間為10小(xiao)時或過夜。

5.6 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝(ning)膠蛋白質(zhi)考馬斯(si)亮(liang)藍染色液（操作步驟(zou)見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書(shu)）。凝膠的大部分區域被深染，在有MMP 條帶的(de)位置不(bu)被染色而形成(cheng)透(tou)亮(liang)區域。

透(tou)明區域的(de)位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(zhi)(酶(mei)譜)及活性(xing)。陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現透明條帶(dai)。

5.7 條(tiao)帶掃(sao)(sao)描(miao)(miao)：將凝膠放在掃(sao)(sao)描(miao)(miao)儀上掃(sao)(sao)描(miao)(miao)。雖然(ran)MMP條帶透(tou)明(ming)，但凝膠(jiao)背(bei)景(jing)并(bing)(bing)非真(zhen)正全(quan)黑。解決(jue)辦法：可(ke)用非透(tou)射(she)光掃描，或用軟(ruan)件圖像處(chu)理程序調整背(bei)景(jing)顯示為灰度顯示，并(bing)(bing)盡量設置為黑色(se)。MMP 條帶則為白(bai)色，這種背景黑條帶白(bai)的格(ge)式是(shi)英(ying)文論文中zui常見的格(ge)式。

明膠酶譜法試劑盒

6.說明(ming)：

1. 10 mM 能(neng)夠EDTA*抑(yi)制(zhi)MMP活性。

2. 凝(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)干燥(zao)：可使(shi)用聚丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺凝(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)干膠(jiao)(jiao)裝置室溫快(kuai)速干燥(zao)凝(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)，作為(wei)*記錄(lu)保留。

明膠酶譜分析試劑盒

7.參(can)考(kao)文獻(xian)：

1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494

2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide

gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102,196–202

SDS-PAGE 凝膠蛋(dan)白質(zhi)考馬斯(si)亮(liang)藍染(ran)色液(ye)說(shuo)明書

常規考馬(ma)斯亮藍SDS-PAGE 凝膠蛋(dan)白質染色是(shi)實驗室常用的凝膠染色方法(fa)。銀染方法(fa)雖然靈敏度高，但(dan)所需試劑復雜(za)并且(qie)有(you)毒(du)有(you)害，操(cao)作(zuo)步(bu)驟(zou)繁瑣，難(nan)以控制獲得好的染色效果(guo)。

染色步(bu)驟：

1. 此(ci)染(ran)色(se)液即為(wei)工作液，使用時直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yang)皿中以考馬斯亮藍染(ran)色(se)液覆(fu)蓋(gai)凝

膠，并緩慢搖動(dong)2h；

2. 傾去染色液，用脫色液沖洗凝膠(jiao)；

3. 以脫色液覆(fu)蓋凝膠，緩(huan)慢搖動2h，傾(qing)去脫(tuo)色(se)(se)液，再加入新(xin)脫(tuo)色(se)(se)液進行脫(tuo)色(se)(se)，直至(zhi)獲得清晰的藍色(se)(se)的條帶(dai)和干(gan)凈(jing)的背景（通(tong)常此過程需(xu)要2～4h，也可脫(tuo)色(se)過夜至(zhi)清晰的(de)藍(lan)色(se)的(de)條帶(dai)和干凈的(de)背景）；

4. 對凝膠(jiao)進行分析(xi)和照相，凝膠(jiao)可(ke)放置在7％的乙酸中保存。也(ye)可用凝膠干膠裝置（P2000）對(dui)

凝膠進(jin)行處理后保存。

安全性(xing)：含有甲醇，無(wu)特殊毒性(xing)，按一般(ban)化學品操作規程處(chu)理。

說明：

1. 染色液配(pei)方：0.25g 考馬斯亮(liang)藍R250+420ml 甲醇(chun)+100ml 冰乙酸，定(ding)容至1000ml，混(hun)合1h 后(hou)用

Whatman 1 號濾(lv)紙過濾(lv)，于(yu)室溫可無限期保存；

2. 脫色(se)液配(pei)方：冰(bing)醋酸:甲醇:水＝7:5:88（V:V:V）；

3. 保存(cun)液：7％冰(bing)醋(cu)酸；

4. 凝(ning)膠染色(se)之后，染色(se)液可以回收利用(yong)，裝入新容器內，室溫(wen)或4 oC 保存，可反復使用(yong)2-4 次。

所有產品僅供(gong)科研(yan)使用(yong)(yong)，不得用(yong)(yong)于食(shi)用(yong)(yong)，醫療(liao)等其它用(yong)(yong)途。