PCR實驗代測的模(mo)板濃度

 服務內容：

1.制定個性化實驗(yan)方案：根據不同的(de)實驗(yan)目的(de)確(que)定實驗(yan)方案、選定合適的(de)內參；

2.檢測類別：mRNA、miRNA、lncRNA、DNA；

3.樣(yang)本(ben)抽(chou)提及(ji)質(zhi)檢：對客戶(hu)提供樣(yang)本(ben)進行RNA抽(chou)提，并(bing)利用NanoDrop進行樣(yang)本(ben)質(zhi)檢；

4.定量(liang)PCR預實驗：包括樣本反(fan)轉錄為CDNA、配置PCR反(fan)應體系及進行Real-TimePCR反(fan)應；

5.正式定量PCR實(shi)驗(yan)：根據預實(shi)驗(yan)結果進行(xing)正式實(shi)驗(yan)；

6.數據分(fen)析：采用2- △△CT法進行分(fen)析，比較(jiao)不同(tong)樣本(ben)間差異。

影(ying)響Ct值的關(guan)鍵因素

模板濃(nong)度

模板濃度是決定Ct的(de)最(zui)主要因素。控制在一個合適(shi)范圍內(nei)，使(shi)Ct在15-35之間

反應液成分的(de)影響

任(ren)何分子的(de)熒光發(fa)射都受環境因素影(ying)響----比如溶液的(de)pH值和鹽濃度(du)。

PCR反(fan)應的(de)效率

PCR反應(ying)的(de)效(xiao)率(lv)(lv)也會影響Ct值。在PCR擴增效(xiao)率(lv)(lv)低的(de)條件下(xia)進(jin)行連(lian)續(xu)梯(ti)度稀釋擴增，與PCR擴增效(xiao)率(lv)(lv)高的(de)條件下(xia)相(xiang)比，可能(neng)會所產生(sheng)斜率(lv)(lv)不同(tong)的(de)標準(zhun)曲(qu)線(xian)。PCR效(xiao)率(lv)(lv)取決于實驗、反應(ying)混合(he)液性能(neng)和樣品質量。一般說來，反應(ying)效(xiao)率(lv)(lv)在90-110%之(zhi)間都是可以(yi)接受的(de)。

Real-time qPCR常見(jian)參數(shu)

基線（baseline）通常是3-15個(ge)循環(huan)的熒光信號

同(tong)一次反(fan)應中(zhong)針對不同(tong)的基因(yin)需單獨設(she)置基線

閾值（threshold）

自動設置是(shi)3-15個循環的(de)熒(ying)光信號的(de)標準偏(pian)差的(de)10倍

手動設置(zhi)：置(zhi)于(yu)指數擴增期，剛好可(ke)以清楚(chu)地看(kan)到熒光信號明顯增強

同一(yi)(yi)次反應中針對(dui)不同的基因可單獨設置閾值(zhi)(zhi)，但對(dui)于同一(yi)(yi)個基因擴增一(yi)(yi)定要用同一(yi)(yi)個閾值(zhi)(zhi)。

Ct值(zhi):與起(qi)始(shi)濃度的(de)對數成(cheng)線性(xing)關(guan)系。

分析定量(liang)時候一(yi)般取Ct:15-35。太大或者太小都(dou)會導致定量(liang)的不準(zhun)確。

Rn（Normalized reporter）是(shi)熒光(guang)報(bao)告基團的熒光(guang)發射(she)強度與參比染料的熒光(guang)發射(she)強度的比值。

△Rn：△Rn是Rn扣除基(ji)線后得到的標準化(hua)結果(guo)（△Rn=Rn-基(ji)線）。

如何評估實(shi)時定量PCR反應的效果

PCR擴增效(xiao)(xiao)率：為了正確地(di)評估PCR擴增效(xiao)(xiao)率，至少(shao)需要做(zuo)3次平(ping)行重(zhong)復，至少(shao)做(zuo)5個數(shu)量級倍(bei)數(shu)(5logs)連續(xu)梯度稀釋模板(ban)濃度。

另一(yi)個(ge)(ge)評估PCR效率的(de)關(guan)鍵參數是相關(guan)系數R2，它是說(shuo)明兩(liang)個(ge)(ge)數值(zhi)(zhi)之間相關(guan)程度的(de)統計學術語。如果(guo)R2等于1，那么你(ni)可以(yi)用Y值(zhi)(zhi)（Ct）來準(zhun)確(que)預測X值(zhi)(zhi)（量(liang)）。如果(guo)R2等于0，你(ni)就不能(neng)通過Y值(zhi)(zhi)來預測X值(zhi)(zhi)。R2值(zhi)(zhi)大(da)于0.99 時，兩(liang)個(ge)(ge)數值(zhi)(zhi)之間相關(guan)的(de)可信度很(hen)好。

PCR實驗代測的模板濃度