明膠酶譜檢測試劑盒

簡(jian)介：

基質金(jin)屬蛋(dan)白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的(de)酶(mei)原(yuan)形式分泌，活化后(hou)能夠降解細(xi)(xi)胞外(wai)基(ji)質(zhi)的(de)膠(jiao)原(yuan)蛋(dan)白，又(you)稱膠(jiao)原(yuan)酶(mei)。通(tong)過(guo)影響細(xi)(xi)胞外(wai)基(ji)質(zhi)，膠(jiao)原(yuan)酶(mei)參(can)與(yu)胚胎發(fa)育(yu)、形態發(fa)生、組織重塑等過(guo)程(cheng)，并(bing)參(can)與(yu)炎(yan)癥、腫(zhong)瘤、心血管、神經(jing)等許多疾(ji)病過(guo)程(cheng)。血漿與(yu)組織中的(de)MMP-2、MMP-9參(can)與(yu)各種生理與(yu)病理過(guo)程(cheng)，其在診斷和治療中的(de)意(yi)義日(ri)益(yi)受到重視。

本試劑盒采用酶譜(pu)法(zymography)檢測 MMP-2、MMP-9 活性Zymography 是一種廣為使用(yong)的、基于 SDS-PAGE 電泳和反相凝(ning)膠染色(se)的蛋白酶檢測方法(fa)，其(qi)靈敏度可達(da) 1nM，高(gao)于 ELISA 方法 2，其基(ji)本原理和程序是: 制備(bei)加有膠(jiao)(jiao)原酶底物的 SDS-PAGE 凝膠(jiao)(jiao)，含蛋(dan)(dan)白(bai)酶的樣(yang)品在(zai)此凝膠(jiao)(jiao)中進行電泳，電泳結束后取(qu)出凝膠(jiao)(jiao)與(yu)酶反應 Buffer 孵育，凝膠(jiao)(jiao)染色與(yu)脫色。凝膠(jiao)(jiao)中由于含底物蛋(dan)(dan)白(bai)而(er)(er)被深染，形成深色背景，但(dan)在(zai)有蛋(dan)(dan)白(bai)酶條(tiao)帶的位置，蛋(dan)(dan)白(bai)酶將降解舒膠(jiao)(jiao)中的底物蛋(dan)(dan)白(bai)，因而(er)(er)不被染色而(er)(er)形成透(tou) 亮區域(yu)，從而(er)(er)能同時指示 MMP-2、MMP-9 的(de)大小位置(酶譜(pu))及(ji)活(huo)性(xing)。本試劑盒(he)提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及(ji)酶學(xue)反應緩中液，可檢(jian)測少至0.10-0.5ul血液中的MMP-2、MMP-9 譜(pu)及活性，檢(jian)測靈敏度~1 nM。試(shi)劑盒可進行(xing) 50 次標準(zhun)小較檢(jian)測，如果小較加樣為 10-15個，則總(zong)計可(ke)檢測(ce)500-750 個樣品。

檢測(ce)目的:

本試劑盒用于檢測MMP-2、MMP-9 酶譜及(ji)活性(xing)（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM）

檢測步驟：

5.1 制備(bei)含MMP底(di)物(wu)蛋白的SDS-PAGE凝(ning)(ning)膠(jiao)：推(tui)薦分離(li)膠(jiao)濃度為8%。按照標(biao)準程序制備(bei)SDS PAGE凝(ning)(ning)膠(jiao)。將10 × substrate G 融化，并90 oC 加熱5分鐘。分別(bie)在濃縮膠(jiao)和分離(li)膠(jiao)中額(e)外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍(bei)，混勻后加入過硫酸銨(an)和TEMED，等(deng)待凝(ning)(ning)膠(jiao)聚合。、

5.2 待測樣品1:1 稀釋于(yu)2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用(yong)完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直(zhi)接上(shang)(shang)樣。切勿加熱變性，并且僅使(shi)用(yong)不(bu)加還原劑的上(shang)(shang)樣緩沖液。可通過預試驗確定加樣量，使(shi)用(yong)普(pu)通蛋白預染Marker 即可。陽性對照(可選步驟)：可取(qu)人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體(ti)積混合，取(qu)5-15μl 上(shang)(shang)樣。

注：因(yin)為全(quan)血成(cheng)分復雜,MMP活性較(jiao)低，的(de)方法是將全血中白細胞進行分離做陽(yang)性對照

5.3 低電流恒(heng)流電泳，每一塊小(xiao)膠電流為20 mA/gel。溴酚(fen)藍(lan)跑出(chu)凝膠前沿時結束電泳。

5.4 洗滌凝(ning)膠：取出(chu)凝(ning)膠，去除濃縮膠，放(fang)入容(rong)器內。可先用適(shi)量蒸餾水沖洗凝(ning)膠，然后(hou)加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀(xi)釋(shi))，室溫漂(piao)洗凝(ning)膠2 × 30 分鐘。中間換液。

5.5 孵育(yu)：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫(wen)或37oC 孵育(yu)1~5 小(xiao)時。陽性(xing)對照或者血中的(de)MMP 通常37oC 孵育(yu)1 小(xiao)時即可顯(xian)示(shi)。如(ru)MMP 活性(xing)低，應延長孵育(yu)時間為10小(xiao)時或過夜(ye)。

5.6 顯色(se)(se)：倒(dao)掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠(jiao)蛋白質考馬(ma)斯亮藍染色(se)(se)液（操(cao)作步驟見(jian)后面所(suo)附SDS-PAGE凝膠(jiao)蛋白質考馬(ma)斯亮藍染色(se)(se)液說明書）。凝膠(jiao)的(de)大部分區(qu)域被深染，在(zai)有MMP 條帶的(de)位(wei)(wei)置(zhi)不被染色(se)(se)而(er)形成透亮區(qu)域。透明區(qu)域的(de)位(wei)(wei)置(zhi)和范圍(wei)指示MMP-2、MMP-9 的(de)大小位(wei)(wei)置(zhi)(酶譜)及活(huo)性。陽性對照將在(zai)66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位(wei)(wei)置(zhi)出現透明條帶。

5.7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖(sui)然MMP條帶透明，但(dan)凝膠背(bei)景并非真(zhen)正全黑(hei)。解決辦法：可用(yong)非透射光掃描，或用(yong)軟(ruan)件圖(tu)像處理(li)程序調(diao)整背(bei)景顯示為灰度顯示，并盡量(liang)設置(zhi)為黑(hei)色。MMP 條帶則為白色，這種背(bei)景黑(hei)條帶白的格(ge)式(shi)是英文論文中zui常(chang)見(jian)的格(ge)式(shi)。

檢測原(yuan)理(li)：

本試劑盒采用(yong)酶(mei)譜法(Zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種(zhong)廣為使用的(de)、基(ji)于(yu)SDS-PAGE 電(dian)泳和反相凝(ning)膠(jiao)染(ran)(ran)色(se)的(de)蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)檢測方法，其靈敏(min)度可達1 nM，高于(yu)ELISA方法，其基(ji)本原理1和程序是：制備加有膠(jiao)原酶(mei)(mei)底物(wu)的(de)SDS-PAGE 凝(ning)膠(jiao)，含蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)的(de)樣(yang)品在(zai)此(ci)凝(ning)膠(jiao)中(zhong)進行(xing)電(dian)泳，電(dian)泳結束后取出凝(ning)膠(jiao)與(yu)酶(mei)(mei)反應Buffer 孵育(yu)，凝(ning)膠(jiao)染(ran)(ran)色(se)與(yu)脫色(se)。凝(ning)膠(jiao)中(zhong)由于(yu)含底物(wu)蛋白(bai)(bai)而被(bei)深染(ran)(ran)，形成深色(se)背(bei)景，但在(zai)有蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)條(tiao)帶的(de)位置(zhi)，蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)將降解(jie)凝(ning)膠(jiao)中(zhong)的(de)底物(wu)蛋白(bai)(bai)，因而不被(bei)染(ran)(ran)色(se)而形成透亮區域，從而能(neng)同(tong)時指(zhi)示MMP-2、MMP-9 的(de)大(da)小位置(zhi)(酶(mei)(mei)譜(pu))及(ji)活性。本試(shi)劑盒(he)提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白(bai)(bai)底物(wu)及(ji)酶(mei)(mei)學反應緩沖液，可檢測少至(zhi)0.1~0.5 μl 血液中(zhong)的(de)MMP-2、MMP-9 酶(mei)(mei)譜(pu)及(ji)活性，檢測靈敏(min)度~1nM。試(shi)劑盒(he)可進行(xing)50次標準(zhun)小膠(jiao)檢測，如果小膠(jiao)加樣(yang)孔為10~15個(ge)，則總計可檢測500~750個(ge)樣(yang)品。

說明：

1. 10 mM 能夠EDTA*抑(yi)制(zhi)MMP活性。

2. 凝(ning)膠干(gan)燥(zao)(zao)：可使用(yong)聚丙(bing)烯酰胺凝(ning)膠干(gan)膠裝置室溫快(kuai)速干(gan)燥(zao)(zao)凝(ning)膠，作為(wei)*記(ji)錄保留(liu)。

參考文獻：

1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494

2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide

gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102,196–202

SDS-PAGE 凝(ning)膠(jiao)蛋白質考馬斯(si)亮藍染色液說明書

常規考馬斯(si)亮藍SDS-PAGE 凝膠(jiao)蛋白質染色(se)是實(shi)驗室常用(yong)的(de)凝膠(jiao)染色(se)方法。銀染方法雖然靈(ling)敏(min)度高，但所需試(shi)劑復(fu)雜并且(qie)有毒有害，操作步驟(zou)繁瑣，難以控制獲得好(hao)的(de)染色(se)效果。

安全性(xing)：含有(you)甲(jia)醇(chun)，無特殊毒性，按(an)一(yi)般化(hua)學品操作規(gui)程處理。

染(ran)色(se)步驟(zou)：

1. 此染色液(ye)(ye)即為工作液(ye)(ye)，使用時直(zhi)接將聚丙烯(xi)酰胺凝膠(jiao)放在(zai)培養皿中以考馬斯亮(liang)藍染色液(ye)(ye)覆蓋凝膠(jiao)，并緩慢(man)搖動2h；

2. 傾去染色(se)液(ye)，用(yong)脫色(se)液(ye)沖洗凝膠(jiao)；

3. 以脫(tuo)色(se)液覆蓋凝(ning)膠，緩慢(man)搖動2h，傾(qing)去脫(tuo)色(se)液，再加入新脫(tuo)色(se)液進行脫(tuo)色(se)，直(zhi)至(zhi)獲得清晰的(de)(de)(de)(de)藍色(se)的(de)(de)(de)(de)條帶和干(gan)凈的(de)(de)(de)(de)背景（通常此(ci)過程(cheng)需要(yao)2～4h，也可脫(tuo)色(se)過夜至(zhi)清晰的(de)(de)(de)(de)藍色(se)的(de)(de)(de)(de)條帶和干(gan)凈的(de)(de)(de)(de)背景）；

4. 對凝(ning)(ning)膠(jiao)進(jin)(jin)行分析和(he)照相，凝(ning)(ning)膠(jiao)可(ke)放置(zhi)在7％的(de)乙(yi)酸中(zhong)保存。也可(ke)用凝(ning)(ning)膠(jiao)干膠(jiao)裝(zhuang)置(zhi)（P2000）對凝(ning)(ning)膠(jiao)進(jin)(jin)行處理后保存。

說明：

1. 染色液配方：0.25g 考(kao)馬斯亮藍(lan)R250+420ml 甲醇(chun)+100ml 冰乙酸，定容至1000ml，混合1h 后(hou)用Whatman 1 號濾紙過(guo)濾，于室溫(wen)可無(wu)限期保存；

2. 脫色液配(pei)方(fang)：冰(bing)醋酸:甲醇(chun):水＝7:5:88（V:V:V）；

3. 保存液：7％冰(bing)醋(cu)酸；

4. 凝(ning)膠染色之后，染色液可(ke)以回收利用(yong)，裝入(ru)新容器內，室溫或4 oC 保存，可(ke)反復使用(yong)2-4 次。

本產品僅供科研，不得用于臨(lin)床，醫療，食用等

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明膠酶(mei)譜檢測試劑盒