信帆生物代做免疫組化實驗(yan)，技術穩定，實驗(yan)結果可靠。提(ti)供(gong)技術指導和售后服務，價(jia)格(ge)實惠！歡迎廣大科研客(ke)戶朋友！代測，試(shi)劑盒!

免疫組化實驗檢測主要操作步驟：

1、洗載玻片：將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中，目的是為了是載玻片上的硅膠等除去，同時使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面變平整，便于組織吸附，然后置于清水中清洗，除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個小時左右)，再將載玻片浸泡于酒精之中，然后放到架子上，置于37°C溫箱中，將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys帶正電，而大多數的組織帶負電荷，從而產生吸附作用。
2、包埋組織：先在鐵模具中加入一些液態石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，最后加入少許液體石蠟，進行冷凍，使石蠟變成固態。
3、切片：將包埋好的組織從模具上取下來，并置于石蠟切片機上，切片機通過調節上下左右來來使組織和切割方向，然后調節切片的厚度，一般為5µm，如果比較難切，則可以適當調整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。
4、撈組織：當組織載玻片置于40°C溫水中之前，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開，是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時，一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織，做對照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時候方向，以便觀察，再將撈出來的載玻片置于架子上，放入37°C溫箱中烘干。
5、脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯，依據的是相似相溶的原理。一般在每個試劑中放10min，天氣熱可以少放幾分鐘，相反，天氣較冷的話，就要適當延長脫蠟時間，一般為12-15min。
6、抗原修復：脫蠟后在清水中沖洗一段時間，加入3%H2O2浸泡10min，從而除去內源性的過氧化氫酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點暴露出來。
7、血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干組織周圍的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點封閉起來，然后放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍（900µlPBS：100µl血清封閉液）。
8、加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加一抗，如果做對照實驗，就在對照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過一夜。
9、加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗，然后置于37°C溫箱中半小時。
10、加SABC：將片子從溫箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上SABC，然后置于37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍（990µlPBS：10µlSABC）。
11、加顯色劑：將片子從溫箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）   A：DAB、B：H2O2、    C：磷酸緩沖液。
12、復染：將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動物組織為半分鐘，植物組織3-5min。
13、脫水：將復染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通風柜中。
14、封片：用中性樹膠滴在組織旁(pang)邊，再用蓋(gai)玻片蓋(gai)上(shang)，要(yao)先(xian)放平一側(ce)(ce)，然后輕(qing)輕(qing)放下另一側(ce)(ce)，以(yi)免(mian)產生(sheng)氣(qi)泡(pao)，封好片子后置于通風柜中晾干。

免疫組化實驗檢測注意事項：

切片(pian)組織得(de)到(dao)很好處(chu)(chu)理(li)(li)(li)后(hou)在進行切片(pian)之前還應對玻(bo)(bo)璃(li)片(pian)進行處(chu)(chu)理(li)(li)(li)，由于我們檢(jian)測抗原是(shi)多種(zhong)多樣(yang)的，因染色操作程(cheng)序復(fu)雜，時間較(jiao)長，有些抗原是(shi)要進行各種(zhong)抗原修(xiu)復(fu)處(chu)(chu)理(li)(li)(li)，如微波、高(gao)壓、水溶酶(mei)等，玻(bo)(bo)片(pian)如果(guo)得(de)不到(dao)很好的處(chu)(chu)理(li)(li)(li)，將易(yi)造成脫片(pian)，為保證實(shi)驗的正常(chang)進行，要求在貼片(pian)前對載玻(bo)(bo)片(pian)作適(shi)當處(chu)(chu)理(li)(li)(li)，必須在清洗干(gan)凈的玻(bo)(bo)片(pian)上(shang)進行粘合劑的處(chu)(chu)理(li)(li)(li)以防脫片(pian)。

1)Poly-L-Lysine 

一(yi)般采用分子量30000左右的(de)(de)0.5%多聚(ju)賴氨酸(suan)，也可用試劑公司(si)出售的(de)(de)其濃溶液以1：10去離子水(shui)稀(xi)釋。方法是將玻片浸泡其中，傾盡余液，在60℃溫(wen)箱中烤干備用，此方法的(de)(de)優點是可以用于多種組織(zhi)化學、及(ji)分子學檢(jian)測中的(de)(de)應用，粘貼效果，但價格稍貴。

2)明膠硫酸鉻鉀法

將2.5g明膠加熱溶(rong)于500ml蒸(zheng)餾水中(zhong)，溶(rong)解冷卻后(hou)加入0.25g硫酸鉻鉀攪(jiao)勻充分溶(rong)解即可(ke)使(shi)(shi)用(yong)(yong)。方(fang)法是(shi)將玻片浸泡其中(zhong)2 min，取出控盡液(ye)體(ti)入溫箱中(zhong)烤干備用(yong)(yong)。此(ci)法價(jia)格便宜、方(fang)法簡單，任何(he)實驗都可(ke)以(yi)使(shi)(shi)用(yong)(yong)，特(te)別(bie)適用(yong)(yong)于大(da)批量(liang)的使(shi)(shi)用(yong)(yong)，但應注意，如果液(ye)體(ti)變(bian)藍或(huo)粘(zhan)稠狀停用(yong)(yong)。

3)APES (3-氨丙基-乙氧(yang)基甲硅烷)

此(ci)法必須現用現配。將洗凈玻片入(ru)1:50丙酮(tong)稀釋的APES中，浸泡20s，取出稍停再入(ru)丙酮(tong)或蒸(zheng)餾(liu)水(shui)中刷(shua)去(qu)末結合的APES晾干即可(ke)。用此(ci)方法粘(zhan)合的玻片應垂直烤片不能(neng)平拷，否(fou)則組(zu)織(zhi)片中易(yi)出現氣泡。

切(qie)片(pian)必須保持(chi)切(qie)片(pian)刀銳利，切(qie)片(pian)要薄而平整、無皺摺、無刀痕(hen)，如有上述問題的(de)切(qie)片(pian)在進(jin)行染色都將出現(xian)假陽性現(xian)象(xiang)，切(qie)片(pian)厚度一(yi)般為(wei)3~4μm，切(qie)好的(de)切(qie)片(pian)在60℃溫箱中過(guo)一(yi)夜，注(zhu)意烤片(pian)的(de)溫度不宜過(guo)高，否則易使(shi)組織(zhi)細胞結(jie)構破壞，而產(chan)生抗(kang)原標(biao)記定位彌漫現(xian)象(xiang)。

所有產品僅供科研使用，不得用于食用，醫療等其它用途。